Przez
Technologia ACE umożliwia wysoce multipleksowane i czułe wzmacnianie sygnału w celu wykrywania białek w pojedynczych komórkach przy użyciu zawiesinowej cytometrii masowej analizy zawiesiny pojedynczych komórek i obrazowania za pomocą cytometrii masowej. Ta ilustracja pokazuje, jak można określić ilościowo białka w poszczególnych komórkach wycinka tkanki za pomocą wiążących się z nimi przeciwciał wzmocnionych ACE. Źródło: Su Min Suh/SciStories
ACE, przełom DNA-technologia wzmocnionego sygnału znacznie zwiększa czułość cytometrii mas, zapewniając nowy wgląd w różne procesy biologiczne i patologiczne.
Od lat pięćdziesiątych XX wieku badacze stosują „cytometrię przepływową”, znaną technikę opracowaną przez Wallace’a Coultera, do charakteryzowania różnych typów komórek odpornościowych w badaniach naukowych i próbkach ludzkiej krwi. Metoda ta znacznie pogłębiła naszą wiedzę na temat rozwoju komórek odpornościowych i zapewniła innowacyjne podejście do oceny zdrowia ludzkiego i diagnozowania różnych nowotworów krwi. Ostatecznie cytometrię przepływową rozszerzono na analizę innych typów komórek.
W tradycyjnej cytometrii przepływowej białka powierzchniowe i wewnątrzkomórkowe wykrywa się za pomocą cząsteczek przeciwciał połączonych z sondami fluorescencyjnymi. Jednakże metoda ta, zapewniając czułość na pojedyncze komórki, ma ograniczenia w wykrywaniu wielu białek ze względu na liczbę fluoroforów, które można wyraźnie rozróżnić w całym spektrum światła fluorescencyjnego.
Pojawienie się „cytometrii masowej” w 2009 r. umożliwiło jednoczesne oznaczenie ilościowe 50 białek w pojedynczych komórkach oraz bardziej szczegółową analizę tożsamości komórek i stanów fizjologicznych. W cytometrii masowej przeciwciała są łączone z nieradioaktywnymi izotopami pierwiastków metalicznych. Izotopy te można określić ilościowo w różnych kanałach instrumentu cytometru masowego na podstawie ich masy. Jednakże cytometria masowa i jej kuzynka „obrazowa cytometria masowa” (IMC), która służy do wizualizacji białek komórkowych w nienaruszonych skrawkach tkanki, odbywały się kosztem zmniejszonej czułości w porównaniu z cytometrią przepływową i mikroskopią fluorescencyjną.
Teraz, kolejne 15 lat później, współpraca badawcza prowadzona przez Instytut Wyss na Uniwersytecie Harvarda, w której uczestniczyli także badacze z MIT a Uniwersytet w Toronto opracował metodę znacznego zwiększenia czułości cytometrii mas i IMC przy użyciu nanotechnologii DNA. Stosując nową technologię amplifikacji sygnału o nazwie „Amplification by Cyclic Extension” (ACE) do kodów kreskowych DNA połączonych z przeciwciałami, udało im się ponad 500-krotnie wzmocnić sygnały białkowe wytwarzane przez izotopy metali związane z przeciwciałami, jednocześnie i z dużą czułością. wykryć ponad 30 różnych białek.
Nowa metoda umożliwiła im ilościowe wykrywanie rzadkich białek, badanie złożonych zmian biologicznych w tkankach i badanie, w jaki sposób całe sieci wzajemnie połączonych białek regulujących funkcje komórek odpornościowych reagują na stymulację i stany patologiczne. Zastosowany do IMC, ACE umożliwił także identyfikację typów komórek i przedziałów tkankowych w skrawkach histologicznych oraz zmian w organizacji tkanek związanych z patologią policystycznych chorób nerek. Wyniki opisano w Biotechnologia Przyrody.
„ACE pomaga wypełnić kluczową lukę w analizie cytometrycznej: zwiększając czułość cytometrii mas, umożliwia platformę analizy pojedynczych komórek, która jednocześnie osiąga wysoką czułość, wysokie multipleksowanie i wysoką przepustowość. Możliwości, jakie otwiera w zakresie badania pojedynczych komórek w zawiesinie i nienaruszonych tkankach przy użyciu wysoce multipleksowych i czułych metod, mogą zapewnić znacznie głębsze zrozumienie normalnych i patologicznych procesów biologicznych”, powiedziała Peng Yin, członkini Wydziału Głównego Instytutu Wyss, która kierowała badaniem badanie. Yin jest także profesorem na Wydziale Biologii Systemów (HMS).
Więcej DNA, więcej izotopów metali, większa czułość
Wcześniej Yin i jego grupa z Wyss Institute opracowali wiele technologii obrazowania wykorzystujących DNA, które mogą ujawnić wewnętrzne funkcjonowanie komórek z ultrawysoką rozdzielczością na poziomie pojedynczej cząsteczki lub poprzez wizualizację wielu różnych RNA i cząsteczki białka w pojedynczym kawałku tkanki. Struktury DNA utworzone tymi metodami nie są jednak wystarczająco odporne, aby wytrzymać stosunkowo trudne warunki stosowane w cytometrii mas.
„ACE rozwiązuje obecne problemy związane z czułością cytometrii mas, umożliwiając naukowcom wiązanie cząsteczek przeciwciał ze znacznie zwiększoną liczbą izotopów metali w porównaniu z konwencjonalną cytometrią mas. To znacznie ułatwia ocenę ilościową szerokiego zakresu białek o niskiej liczebności, co stanowiło wyzwanie w przypadku poprzednich podejść jednokomórkowych” – powiedziała współpierwsza autorka, dr Xiao-Kang Lun, która jest stażystką podoktorską w grupie Yina . Lun współpracował przy projekcie z pierwszym autorem, doktorem Kuanwei Shengiem, który początkowo opracował ACE do innych zastosowań, w tym do obrazowania multipleksowego, a także jest stażystą podoktorskim współpracującym z Yin. „Zainspirowani naszą wcześniejszą pracą nad reakcją wydłużania startera do tworzenia liniowych konkatamerów DNA (wiele kopii tej samej sekwencji DNA połączonych szeregowo) oraz reakcją PCR, która osiąga amplifikację poprzez zsynchronizowane cykle termiczne, wynaleźliśmy ACE do syntezy liniowych konkatamerów na miejscu poprzez cykle termiczne w kontrolowany sposób” – powiedział Sheng.
ACE tworzy rusztowanie z wieloma miejscami wiązania dla krótkich „nić detektora” przenoszących izotopy metali. Ponadto rozgałęziając syntezę nici rusztowania, badacze mogliby jeszcze bardziej zwiększyć czułość metody w wykrywaniu rzadkich białek. Liniowy ACE zapewnia średnio 13-krotne wzmocnienie sygnału, podczas gdy rozgałęziony ACE umożliwia ponad 500-krotne zwiększenie początkowo niewzmocnionego sygnału. Aby ustabilizować cały kompleks sekwencji ACE i zachować go w stanie nienaruszonym podczas analizy metodą cytometrii mas, usieciowano krótkie podwójne nici utworzone pomiędzy rusztowaniem a dodanymi niciami detektora za pomocą chemicznego środka sieciującego. „Zgodnie z tym przepisem zaprojektowaliśmy panel składający się z 33 rozróżnialnych (ortologicznych) sekwencji ACE, których synteza nie koliduje ze sobą, i zastosowaliśmy go do trzech zupełnie różnych typów analiz” – powiedział Sheng, który jest również stażystą podoktorskim w Yin’s zespół.
ACE w pracy
Zespół najpierw wykorzystał ACE do zbadania przejść komórek nabłonkowych do komórek mezenchymalnych i ponownie do komórek nabłonkowych. Przejścia nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) i przejścia mezenchymalno-nabłonkowe (MET) zachodzą podczas rozwoju embrionalnego, ale w szczególności te pierwsze są również odtwarzane, gdy nowotwory stają się inwazyjne i przerzutowe. Dzięki wielokrotnemu profilowaniu łącznie 32 markerów nabłonkowych i mezenchymalnych, cząsteczek sygnałowych i rzadkich czynników transkrypcyjnych w komórkach raka piersi pojedynczej myszy podczas ich 28-dniowego przejścia ze stanu nabłonkowego do stanu mezenchymalnego i z powrotem oraz komputerowej analizie wyników, udało im się rzucić nowe światło na te dwa procesy. „ACE umożliwiło nam profilowanie poziomów czynników transkrypcyjnych o niskiej liczebności jednocześnie z markerami odzwierciedlającymi stany fizjologiczne i sygnalizacyjne komórek w pojedynczych komórkach. Doprowadziło to do bardziej szczegółowego obrazu tego, w jaki sposób programy molekularne w EMT i MET są napędzane przez rosnącą i malejącą ilość kluczowych czynników transkrypcyjnych, w tym Zeb-1 i Snail/Slug” – powiedział Sheng.
W drugim przykładzie przybliżyli wewnętrzne działanie pojedynczych limfocytów T. Stymulacja cząsteczek receptora komórek T (TCR) na ich powierzchni powoduje aktywację złożonej sieci wewnątrzkomórkowych białek sygnalizacyjnych. Analiza tych odpowiedzi sygnalizacyjnych przy rozdzielczości pojedynczych komórek była trudna, również ze względu na mały rozmiar limfocytów T. Poszczególne białka tej sieci są aktywowane przez reszty fosforanowe, które są do nich przyłączone przez inne białka sieciowe, ogólnie znane jako kinazy. Wiele z tych aktywowanych białek sieciowych fosforyluje inne białka sieci. To ostatecznie prowadzi do zmian w zachowaniu komórek T, na przykład w stosunku do patogenów lub komórek nowotworowych. Naukowcy zastosowali ACE do panelu 30 przeciwciał, które specyficznie wiązały się z fosforylowanymi motywami w białkach sieci TCR, pełniących funkcje związane ze stresem, stanem zapalnym, proliferacją komórek i innymi reakcjami. „Korzystając z analizy cytometrii mas wzmocnionej ACE, przechwyciliśmy ilościowe migawki dynamicznie zmieniającej się sieci TCR w poszczególnych pierwotnych ludzkich limfocytach T. Pozwoliło nam to zbadać różnice w czasie i czasie trwania specyficznych zdarzeń aktywacji limfocytów T w pojedynczych komórkach oraz odkryć, w jaki sposób sieć jest aktywowana ze stanu podstawowego za pomocą sygnałów zewnątrzkomórkowych” – powiedział Lun.
Zespół wykorzystał ten sam panel przeciwciał wzmocnionych ACE do zbadania zjawiska znanego jako „paraliż komórek T wywołany urazem”. Limfocyty T doświadczające uszkodzeń w swoim otoczeniu, takich jak urazy tkanek spowodowane poważnymi zabiegami chirurgicznymi, często stają się immunosupresyjne. Aby zacząć rozumieć, w jaki sposób sieć TCR to powoduje, grupa Yina nawiązała współpracę ze współautorem dr Michaelem Yaffe, który jest profesorem nauk ścisłych Davida H. Kocha oraz profesorem biologii i inżynierii biologicznej na MIT i ma duże zainteresowanie tym, jak mikrośrodowisko otaczające miejsca uszkodzenia tkanki tłumi układ odpornościowy. Yaffe dostarczył zespołowi próbki „pooperacyjnego płynu drenażowego” (POF) pobrane od pacjentów poddawanych operacji. Stymulowanie limfocytów T za pomocą POF oraz ich TCR umożliwiło naukowcom wyizolowanie wyraźnych zmian w sieci, które powodują, że pojedyncze komórki T przestają się dzielić i ulegają wyczerpaniu.
Na koniec zbadali przydatność ACE także do analizy przestrzennej białek w skrawkach tkanek przy użyciu IMC, skupiając się na ludzkiej nerce. Tkankę nerkową trudno jest analizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej ze względu na silną autofluorescencję oraz za pomocą tradycyjnej IMC ze względu na brak czułości. Naukowcy opracowali panel 20 przeciwciał o wzmocnionym ACE dla różnych markerów nerek i wykorzystali go do zbadania skrawków kory nerkowej pochodzących od pacjenta z policystyczną chorobą nerek. To podejście, w ramach którego współpracowali ze współautorem dr Hartlandem Jacksonem, profesorem na Uniwersytecie w Toronto w Kanadzie i ekspertem w dziedzinie obrazowania multipleksowego, pozwoliło im zidentyfikować różne typy komórek i ich organizację w bliższej i dalszej części nerki kanaliki, przewody zbiorcze i kłębuszki filtrujące krew. „Odkryliśmy nowe, specyficzne dla choroby cechy organizacji komórek i tkanek i odkryliśmy, że marker komórek macierzystych Nestin, który jest również powiązany z chorobami nerek, ulega bardzo heterogennej ekspresji w kłębuszkach” – powiedział Lun. „Może to oznaczać, że różne części tkanki mogą jednocześnie przechodzić przez różne stadia patologiczne”.
„To nowe podejście do cytometrii mas opracowane przez zespół Peng Yin i ich współpracowników po raz kolejny pokazuje, jaką siłę można wykorzystać nanotechnologię DNA w celu doładowania istniejącej techniki, która jest bardzo istotna w opiece klinicznej, oraz podniesienia jej na znacznie wyższy poziom czułości i swoistości. Ta stosunkowo prosta metoda doprowadzi do zupełnie nowego spojrzenia na funkcjonowanie komórek, tkanek i narządów, zarówno w stanie zdrowia, jak i choroby” – powiedział współautor i dyrektor założyciel Wyss, dr Donald Ingber, którego grupa zapewniła krytyczną wiedzę specjalistyczną na stymulację limfocytów T. On jest także Judah Folkman Profesor biologii naczyń w HMS i Boston Children’s Hospital oraz Hansjörg Wyss Profesor inżynierii bioinspirowanej w Harvard School of Engineering and Applied Sciences im. Johna A. Paulsona.
Odniesienie: „Wzmocnienie sygnału poprzez wydłużanie cykliczne umożliwia wysokoczułą cytometrię masową pojedynczych komórek” autorstwa Xiao-Kang Lun, Kuanwei Sheng, Xueyang Yu, Ching Yeung Lam, Gokul Gowri, Matthew Serrata, Yunhao Zhai, Hanquan Su, Jingyi Luan, Youngeun Kim, Donald E. Ingber, Hartland W. Jackson, Michael B. Yaffe i Peng Yin, 29 lipca 2024 r., Biotechnologia Przyrody.
DOI: 10.1038/s41587-024-02316-x
Inni autorzy badania to Xueyang Yu, Ching Yeung Lam, Gokul Gowri, Matthew Serrata, Yunhao Zhai, Hanquan Su, Jingyi Luan i Youngeun Kim. Badanie zostało wsparte grantami z Fundacji im Narodowy Instytut Zdrowia (nagroda nr ES028374, CA226898, UG3HL145600, UH3CA255133, DP1GM133052, R01GM124401, RF1MH124606 i RF1MH128861) oraz Ontario Institute for Cancer Research.
