HiDEF-seq, przełomowa technika opracowana przez NYU Langone Health, umożliwia wczesną identyfikację DNA zmiany poprzedzające mutacje, zwiększając wiedzę na temat zaburzeń genetycznych i starzenia się.
Mutacje to zmiany w „literach” molekularnych tworzących kod DNA, który służy jako wzór dla wszystkich żywych komórek. Chociaż niektóre z tych zmian mają minimalny wpływ, inne mogą powodować choroby, takie jak rak. W niedawnym badaniu wprowadzono nową technikę zwaną HiDEF-seq, która umożliwia precyzyjne wykrywanie wczesnych zmian molekularnych w kodzie DNA zachodzących przed mutacjami.
Autorzy badania twierdzą, że ich technika – HiDEF-seq, skrót od Hairpin Duplex Enhanced Fidelity Sequencing – może pomóc w zrozumieniu podstawowych przyczyn mutacji, zarówno w zdrowych komórkach, jak i w nowotworach, oraz w jaki sposób zmiany genetyczne naturalnie kumulują się w komórkach ludzkich wraz z wiekiem .
Prace prowadzone pod kierunkiem zespołu badaczy z NYU Langone Health i współpracowników z Ameryki Północnej i Danii pomagają ustalić najwcześniejsze etapy powstawania mutacji w DNA.
Zrozumienie struktury DNA i powstawania mutacji
Nowe badanie opiera się na założeniu, że DNA składa się z dwóch nici liter molekularnych, czyli zasad. Każda nić składa się z czterech rodzajów liter: adeniny (A), tyminy (T), guaniny (G) i cytozyny (C). Zasady każdej nici łączą się w pary z zasadami drugiej nici według określonego wzoru, przy czym As łączy się z Ts, a Gs łączy się z Cs.
Umożliwia to replikację kodu DNA i dokładne przekazywanie go z pokolenia na pokolenie. Co ważne, mutacje to zmiany w kodzie DNA, które są obecne w obu niciach DNA. Na przykład para zasad G i C, z G na jednej nici sparowanej z C na drugiej nici, może mutować w parę zasad A i T.
Jednak naukowcy twierdzą, że większość mutacji ma swoje źródło w zmianach DNA, które są obecne tylko w jednej z dwóch nici DNA, a tych zmian w pojedynczej nici, takich jak niedopasowana para zasad G i T, nie można dokładnie zidentyfikować przy użyciu wcześniejszych technik testowych .
Zmiany te mogą wystąpić, gdy nić DNA nie zostanie prawidłowo skopiowana podczas replikacji, gdy komórka dzieli się na dwie komórki lub gdy jedna z dwóch nici DNA zostanie uszkodzona przez ciepło lub inne substancje chemiczne występujące w organizmie. Jeśli te zmiany w jednoniciowym DNA nie zostaną naprawione przez komórkę, istnieje ryzyko, że zmiany te staną się trwałymi mutacjami dwuniciowymi.
Możliwości wykrywania HiDEF-seq
Publikacja w czasopiśmie Naturawykazano, że technika HiDEF-seq wykrywa mutacje dwuniciowe z wyjątkowo wysokim poziomem dokładnośćz oszacowaniem jednego błędu zapisu na 100 bilionów analizowanych par zasad. Co więcej, HiDEF-seq wykrył zmiany w kodzie literowym DNA, gdy były one obecne tylko na jednej z dwóch nici DNA, zanim stały się trwałymi mutacjami dwuniciowymi.
„Nasza nowa technika sekwencjonowania HiDEF-seq pozwala nam zobaczyć najwcześniejsze ślady zmian molekularnych w DNA, gdy zmiany dotyczą tylko pojedynczych nici DNA” – powiedział starszy autor badania Gilad Evrony, doktor medycyny, główny członek Centrum ds. Genetyka człowieka i genomika w Grossman School of Medicine na Uniwersytecie Nowojorskim.
Cel badań i eksperymenty z wykorzystaniem HiDEF-seq
Ponieważ wiadomo, że u osób z zespołami genetycznymi powiązanymi z nowotworem występuje wyższy wskaźnik mutacji w komórkach niż u osób bez predyspozycji do nowotworów, badacze rozpoczęli swoje eksperymenty od opisania zmian w DNA zdrowych komórek osób z tymi zespołami. W szczególności badacze pracowali ze zdrowymi komórkami osób z polipowatością związaną z korektą polimerazy (PPAP), chorobą dziedziczną związaną ze zwiększonym ryzykiem raka jelita grubego, oraz wrodzonym niedoborem naprawy niedopasowań (CMMRD), kolejną chorobą dziedziczną, która zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia kilku nowotworów u dzieci.
Korzystając z HiDEF-seq, badacze odkryli większą liczbę zmian w jednoniciowym DNA w ich komórkach, takich jak T w parze z C zamiast pierwotnego G w parze z C, niż w komórkach osób, które nie miały żadnego z nich. zespół. Co więcej, wzór tych jednoniciowych zmian był podobny do wzorca obserwowanego w przypadku mutacji dwuniciowego DNA u osób z którymkolwiek z tych zespołów.
Kolejne eksperymenty przeprowadzono na ludzkich plemnikach, o których wiadomo, że charakteryzują się jednym z najniższych współczynników mutacji dwuniciowych spośród wszystkich typów komórek ludzkich. Naukowcy odkryli, że wzór uszkodzeń chemicznych, zwanych deaminacją cytozyny, obserwowany przez HiDEF-seq w pojedynczych fragmentach DNA plemników, jest ściśle zgodny z uszkodzeniami obserwowanymi w DNA krwi celowo uszkodzonym przez ciepło. To, zdaniem naukowców, sugeruje, że dwa rodzaje uszkodzeń chemicznych DNA, naturalny i wywołany, zachodzą w wyniku podobnego procesu.
„Nasze badanie kładzie podwaliny pod wykorzystanie techniki HiDEF-seq w przyszłych eksperymentach, które zmienią naszą wiedzę na temat powstawania uszkodzeń i mutacji DNA” – powiedział Evrony, który jest także adiunktem na Wydziale Pediatrii oraz Wydziale Neuronauki i Fizjologii w szkole medycznej Grossman School of Medicine na Uniwersytecie Nowojorskim. Zmiany jednoniciowe w DNA zachodzą nieustannie, gdy komórki dzielą się i mnożą, i choć warstwy mechanizmów naprawczych naprawiają większość zmian, niektóre przedostają się przez nie i stają się mutacjami.
„Naszym długoterminowym celem jest wykorzystanie HiDEF-seq do stworzenia obszernego katalogu niedopasowań i uszkodzeń jednoniciowego DNA, który pomoże wyjaśnić znane wzorce mutacji dwuniciowych” – powiedział Evrony. „Mamy nadzieję w przyszłości połączyć profilowanie jednoniciowych zmian DNA uzyskanych za pomocą HiDEF-seq z wynikającymi z nich mutacjami dwuniciowymi, aby lepiej zrozumieć i monitorować codzienne skutki narażenia środowiskowego na DNA”.
Genetycy szacują, że w każdej ludzkiej komórce istnieje około 12 miliardów zasad lub pojedynczych liter DNA, które mogą zostać uszkodzone lub niedopasowane, ponieważ istnieją dwie kopie kodu genetycznego, z których jedna jest dziedziczona od każdego z rodziców. Każda z tych kopii zawiera dwuniciowy DNA obejmujący 3 miliardy par zasad. Evrony twierdzi, że każda pozycja podstawowa w kodzie genetycznym jest prawdopodobnie uszkodzona lub zmutowana w pewnym momencie życia jednostki, przynajmniej w niektórych komórkach.
Literatura: „Niedopasowanie DNA i wzorce uszkodzeń ujawnione przez sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek” Mei Hong Liu, Benjamin M. Costa, Emilia C. Bianchini, Una Choi, Rachel C. Bandler, Emilie Lassen, Marta Grońska-Pęski, Adam Schwing, Zachary R. Murphy, Daniel Rosenkjær, Shany Picciotto, Vanessa Bianchi, Lucie Stengs, Melissa Edwards, Nuno Miguel Nunes, Caitlin A. Loh, Tina K. Truong, Randall E. Brand, Tomi Pastinen, J. Richard Wagner, Anne-Bine Skytte , Uri Tabori, Jonathan E. Shoag i Gilad D. Evrony, 12 czerwca 2024 r., Natura.
DOI: 10.1038/s41586-024-07532-8
Finansowanie badania zapewniła firma Narodowe Instytuty Zdrowia przyznaje UG3NS132024, R21HD105910, DP5OD028158, T32AG052909, F32AG076287 i P30CA016087. Dodatkowe wsparcie finansowe zapewniły Fundacja Sontag, Fundacja Pew i Fundacja Jacoba Goldfielda.
Evrony i NYU złożyły wniosek patentowy dotyczący metody HiDEF-seq.
Evrony jest właścicielem udziałów w firmach zajmujących się sekwencjonowaniem DNA Illumina, Pacific Biosciences i Oxford Nanopore Technologies, a niektóre z ich produktów zostały przystosowane do wykorzystania w tym badaniu. Wszystkie te ustalenia są zarządzane zgodnie z polityką i praktykami NYU Langone Health.
Oprócz Evrony’ego w badaniu uczestniczyli także inni badacze z NYU Langone, którzy wzięli udział w tym badaniu: Mei-Hong Liu i Benjamin Costa oraz współautorzy: Emilia Bianchini, Una Choi, Rachel Bandler, Marta Gronska-Peski, Adam Schwing, Zachary Murphy, Caitlin Loh i Tinę Truong. Inni współbadacze to Emilie Lassen, Daniel Rosenkjaer, Anne-Bine Skytte z Cryos International Sperm and Egg Bank w Kopenhadze w Danii; Shany Picciotto i Jonathan Shoag z Case Western Reserve University w Cleveland w stanie Ohio; Vanessa Bianchi, Lucie Stengs, Melissa Edwards, Nuno Miguel Nunes i Uri Tabori w Szpitalu dla Chorych Dzieci w Toronto, Kanada; Randall Brand z Uniwersytetu w Pittsburghu w Pensylwanii; Tomi Pastinen, w Children’s Mercy Kansas City w Missouri; i Richarda Wagnera na Universite de Sherbrooke w Kanadzie.
