Naukowcy z instytutów badawczych Rady ds. Badań Medycznych brytyjskiej Rady ds. Badań Medycznych rozwikłali od dawna zagadkę mechanizmów naprawy DNA, potencjalnie usprawniających leczenie raka. Ich badanie ujawniło, w jaki sposób kompleks białkowy FANCD2-FANCI wykrywa i inicjuje naprawę wiązań krzyżowych DNA, wykorzystując zaawansowane techniki obrazowania do wizualizacji tego procesu na poziomie molekularnym.
Naukowcy z LMS i LMB odkryli, w jaki sposób kompleks białek D2-I identyfikuje i naprawia DNA uszkodzeń, przełom, który może ulepszyć metody leczenia raka poprzez lepsze zrozumienie szlaków naprawy DNA. Współpraca ta może utorować drogę skuteczniejszym terapiom poprzez ukierunkowanie na mechanizmy wykorzystywane przez komórki nowotworowe, aby oprzeć się leczeniu.
Współpraca między badaczami z dwóch brytyjskich instytutów Medical Research Council Institute – Laboratorium Nauk Medycznych (LMS) w Londynie i Laboratorium Biologii Molekularnej (LMB) w Cambridge – rozwikłała zagadkę sprzed kilkudziesięciu lat, potencjalnie prowadząc do poprawy leczenia raka w przyszłości.
Praca, która odsłoniła podstawowy mechanizm rozpoznawania uszkodzeń DNA przez jeden z najważniejszych systemów naprawy DNA i inicjowania ich naprawy, przez wiele lat wymykała się badaczom. Wykorzystując najnowocześniejsze techniki obrazowania do wizualizacji, w jaki sposób białka naprawiające DNA przemieszczają się po pojedynczej cząsteczce DNA, oraz mikroskopię elektronową do uchwycenia sposobu, w jaki „blokują się” one do określonych struktur DNA, badania te otwierają drogę do skuteczniejszych metod leczenia raka.
Współpraca między laboratoriami profesora Davida Ruedy (LMS) i dr Lori Passmore (LMB) była doskonałym przykładem tego, jak #teamscience może przynieść owocne wyniki i podkreśla znaczenie tych dwóch instytutów w napędzaniu badań, które odblokowują podstawowe mechanizmy biologii, które będą stanowić podstawę przyszłego przełożenia tych prac na poprawę zdrowia ludzkiego.
Pojedyncza cząsteczka DNA (niewidoczna bezpośrednio) jest wychwytywana za pomocą mikroskopijnych koralików (duże kółka). Każda z czerwonych, zielonych lub żółtych kropek przemieszczających się pomiędzy kulkami reprezentuje kompleks białkowy FANCD2I-FANCI przesuwający się wzdłuż cząsteczki DNA, monitorując ją pod kątem uszkodzeń. Źródło: Laboratorium Nauk Medycznych MRC
Odkrywanie mechanizmu naprawy DNA
Naukowcy pracowali nad szlakiem naprawy DNA, znanym jako niedokrwistość Fanconiego [FA] szlaku, który został zidentyfikowany ponad dwadzieścia lat temu. DNA jest stale uszkadzane przez całe życie pod wpływem czynników środowiskowych, w tym światła UV pochodzącego ze słońca, spożywania alkoholu, palenia, zanieczyszczeń i narażenia na chemikalia. Jednym ze sposobów uszkodzenia DNA jest jego „usieciowanie”, co uniemożliwia mu normalną replikację i ekspresję genów. Aby móc się replikować oraz odczytywać i wyrażać geny, dwie nici podwójnej helisy DNA muszą najpierw rozdzielić się na pojedyncze nici. Kiedy DNA jest usieciowane, „nukleotydy” („stopnie” drabiny podwójnej helisy DNA) obu nici sklejają się ze sobą, uniemożliwiając to rozpięcie.
Nagromadzenie uszkodzeń DNA, w tym sieciowanie, może prowadzić do raka. Ścieżka FA jest aktywna przez całe nasze życie i na bieżąco identyfikuje te uszkodzenia i naprawia je. Osoby z mutacjami zmniejszającymi skuteczność tego szlaku są znacznie bardziej podatne na nowotwory. Chociaż białka biorące udział w szlaku FA odkryto jakiś czas temu, tajemnicą pozostawało to, w jaki sposób zidentyfikowały one usieciowany DNA i rozpoczęły proces naprawy DNA.
Zespół z siostrzanej instytucji MRC LMS, LMB w Cambridge, kierowany przez Lori Passmore, ustalił wcześniej, że kompleks białkowy FANCD2-FANCI (D2-I), który działa na jednym z pierwszych etapów szlaku FA, przyczepia się do DNA, inicjując w ten sposób naprawę DNA na wiązaniach poprzecznych. Pozostały jednak kluczowe pytania: w jaki sposób D2-I rozpoznaje usieciowany DNA i dlaczego kompleks D2-I bierze także udział w innych typach uszkodzeń DNA?
Wyniki badania opublikowane w czasopiśmie Naturawykorzystał połączenie najnowocześniejszych technik naukowych, aby wykazać, że kompleks D2-I ślizga się wzdłuż dwuniciowego DNA, monitorując jego integralność, a także w elegancki sposób zwizualizował, w jaki sposób rozpoznaje, gdzie się zatrzymać, umożliwiając białkom przemieszczanie się i łączenie ze sobą w tym momencie, aby rozpocząć naprawę DNA.
Zaawansowane techniki rzucają światło na interakcje molekularne
Artur Kaczmarczyk i Korak Ray z grupy Single Molecule Imaging Davida Ruedy, współpracujący z Pablo Alcónem z grupy Lori Passmore, wykorzystali najnowocześniejszą technikę mikroskopową znaną jako „skorelowana pęseta optyczna i obrazowanie fluorescencyjne”, aby zbadać, w jaki sposób D2-I złożone slajdy wzdłuż dwuniciowej cząsteczki DNA.
Za pomocą pęsety optycznej mogli uchwycić pojedynczą cząsteczkę DNA pomiędzy dwiema kulkami, co pozwoliło im na precyzyjną manipulację DNA i inkubację z wybranymi białkami. Korzystając ze znakowanego fluorescencyjnie D2-I i obrazowania pojedynczych cząsteczek, zaobserwowali, jak poszczególne kompleksy D2-I wiążą się z DNA i ślizgają się po nim, skanując podwójną helisę. Odkryli, że zamiast bezpośrednio rozpoznawać wiązanie krzyżowe między dwiema niciami DNA, zacisk FA przestaje się przesuwać, gdy dotrze do jednoniciowej przerwy DNA, czyli obszaru, w którym brakuje jednej z dwóch nici DNA.
Film przedstawia mocowanie kompleksu FANCD2-FANCI do DNA w celu jego naprawy. Źródło: Laboratorium Nauk Medycznych MRC, Laboratorium Biologii Molekularnej MRC
Wykorzystując mikroskopię krioelektronową – potężną technikę umożliwiającą wizualizację białek na poziomie molekularnym, naukowcy określili następnie struktury kompleksu D2-I zarówno w jego pozycji ślizgowej, jak i zatrzymanej na styku jednoniciowego i dwuniciowego DNA. Ujawniło to, że kontakty, które D2-I tworzy z tym jednoniciowym-dwuniciowym złączem DNA, różnią się od kontaktów, jakie tworzy z samym dwuniciowym DNA. Pozwoliło im to zidentyfikować konkretną część białka FANCD2, zwaną „helisą KR”, która, jak wykazali w eksperymentach z obrazowaniem pojedynczych cząsteczek, ma kluczowe znaczenie dla rozpoznawania i zatrzymywania szczelin w jednoniciowym DNA.
Pracując z Guillaume Guilbaudem i Julianem Salem w oddziale PNAC LMB oraz Themosem Lioliosem i Puckiem Knipscheerem z Instytutu Hubrechta w Holandii, wykazali ponadto, że zdolność kompleksu D2-I do zatrzymywania się w tych połączeniach przy użyciu helisy KR ma kluczowe znaczenie dla naprawy DNA drogą FA.
Kiedy DNA normalnie replikuje się w naszych komórkach, rozpina dwie nici DNA i kopiuje każdą pojedynczą nić. Tworzy to „widełki replikacyjne”, w których oryginalne nici DNA są rozwijane i na każdej nici powstaje nowy dwuniciowy DNA. Jednakże, gdy widełki te dotrą do wiązania krzyżowego DNA, nici nie mogą zostać rozpięte, co opóźnia zwykły proces replikacji DNA. Zatem zablokowane widełki replikacyjne zawierają odsłonięte jednoniciowe luki, w których DNA został rozwinięty, ale nie uległ replikacji. Badania te wykazały, że to właśnie te połączenia pomiędzy jedno- i dwuniciowym DNA w zablokowanym widełku replikacyjnym są ściśle związane z kompleksem białka D2-I.
Implikacje dla leczenia raka i nie tylko
Pozwala to nie tylko kompleksowi D2-I na wprowadzenie innych białek szlaku FA do sieciowania DNA w celu zainicjowania naprawy, ale także zakotwicza pozostały dwuniciowy DNA, chroniąc zablokowany „widełki replikacyjne” przed enzymami w komórce, które mogłyby przeżuć odsłonięty koniec nici DNA i dalsze uszkodzenie DNA. Praca ta wykazała, że to struktury DNA w widełkach replikacyjnych, które zatrzymują się w wyniku usieciowanego DNA, a nie samo usieciowane DNA, powodują, że kompleks D2-I przestaje się ślizgać i zaciska się na DNA, aby zainicjować naprawa. Te zablokowane widełki replikacyjne pojawiają się w wielu typach uszkodzeń DNA, co wyjaśnia szeroką rolę kompleksu D2-I w innych formach naprawy DNA, a także poprzez szlak FA.
Zrozumienie procesu naprawy DNA i, co ważne, przyczyn jego niepowodzenia ma ogromne znaczenie, ponieważ uszkodzenie DNA jest kluczowym czynnikiem powodującym wiele chorób. Co najważniejsze, wiele leków przeciwnowotworowych, na przykład cisplatyna, działa poprzez wywoływanie tak poważnych uszkodzeń komórkowych komórek nowotworowych, że przestają się one dzielić i umierają. W takich przypadkach ścieżki naprawy DNA – tak ważny proces fizjologiczny w normalnym życiu – mogą zostać przejęte przez komórki nowotworowe, które wykorzystują je, aby oprzeć się działaniu leków stosowanych w chemioterapii. Zrozumienie podstaw mechanistycznych pierwszego etapu naprawy DNA może prowadzić do znalezienia sposobów uwrażliwiania pacjentów, dzięki czemu leki przeciwnowotworowe będą w przyszłości skuteczniejsze.
Odniesienie: „FANCD2–FANCI bada DNA i rozpoznaje połączenia dwu- i jednoniciowe” autorstwa Pablo Alcón, Artur P. Kaczmarczyk, Korak Kumar Ray, Themistoklis Liolios, Guillaume Guilbaud, Tamara Sijacki, Yichao Shen, Stephen H. McLaughlin, Julian E Sale, Puck Knipscheer, David S. Rueda i Lori A. Passmore, 31 lipca 2024 r., Natura.
DOI: 10.1038/s41586-024-07770-w
Praca ta została sfinansowana przez UKRI MRC, Wellcome Trust, Europejską Radę ds. Badań Naukowych i EMBO.
