Anita Saraf bada ślinę komarów, aby zrozumieć, w jaki sposób przenoszone są wirusy takie jak denga i Zachodni Nil, wykorzystując spektrometrię mas do identyfikacji potencjalnych celów szczepionek i terapii.
Można się domyślić, że wyodrębnienie śliny z komara byłoby trudne. I miałbyś rację. Ponieważ jednak komary przenoszą choroby poprzez ślinę, niezwykle istotne jest pobieranie próbek i badanie.
Ale Anita Saraf sama nie zbiera plwocin komarów — są one dostarczane, aby mogła odkryć ich naukowe tajemnice.
Saraf jest dyrektorką Laboratorium Spektrometrii Mas i Proteomiki Analitycznej na Uniwersytecie w Kansas, gdzie wykorzystuje proteomikę typu shotgun do analizy próbek biologicznych — podstawowa nauka, która leży u podstaw wielu terapii lekowych.
„Pobieranie śliny od tych komarów stanowi wyzwanie ze względu na małą wielkość próbki, co jest częstym ograniczeniem w tego typu eksperymentach” – powiedziała. „Nasi współpracownicy z USDA Agricultural Research Service wkładają usta komarów do rurki, następnie stymulują wydzielanie śliny i zbierają ślinę”.
Teraz, dzięki nowemu dwuletniemu grantowi w wysokości 250 000 dolarów rocznie od Narodowego Funduszu Bio i Agroobrony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, Saraf analizuje obecnie te próbki niezakaźnej śliny komarów w walce z „arbowirusami” – terminem określającym rozprzestrzenianie się wirusów przez stawonogi, takie jak komary.
Należą do nich Zachodni Nil, żółta febra, denga, japońskie zapalenie mózgu i inne wirusy, które mogą zaszkodzić lub zabić ludzi, zwierzęta i rośliny. USDA jest zainteresowane zastosowaniami weterynaryjnymi w związku z odkryciami, ale praca Sarafa może stanowić podstawę terapii również dla ludzi.
„USDA chce zbadać, w jaki sposób wirus wpływa na układ odpornościowy i powoduje zmiany na poziomie molekularnym, szczególnie w proteomie śliny komarów” – powiedział Saraf. „Kiedy wirus infekuje komara, zmienia on białka i inne podstawowe składniki komara, podobnie jak malaria wpływa na ludzkiego żywiciela w miarę jego przechodzenia przez różne etapy”.
Techniki analizy proteomicznej
Analiza proteomiczna śliny przeprowadzona przez Sarafa zakończyła się sukcesem dzięki zastosowaniu bardzo wydajnych metod przetwarzania próbek w połączeniu z analizą metodą shotgun. To podejście jest skuteczne w przypadku bardzo małych objętości lub ilości próbek, takich jak na przykład trudna do zdobycia ślina komara.
„W naszym rdzeniu spektrometrii mas na ALK używamy proteomiki typu shotgun, nanoskala chromatografia cieczowa w połączeniu z tandemową spektrometrią mas, czyli nLC-MS, która wymaga jedynie minimalnej ilości białka w zakresie nanogramów, co czyni ją idealną do tego typu próbek biologicznych” – powiedział Saraf. „Czułość naszego zestawu jest kluczowa, ponieważ bez niej potrzebowalibyśmy znacznie większych ilości białka. Po otrzymaniu próbek śliny zajmujemy się całą obróbką, przygotowaniem i trawieniem próbek, aby przygotować je do analizy za pomocą spektrometrii mas. Dysponujemy najnowocześniejszym sprzętem i specjalną konfiguracją, która zapewnia nam wysoką czułość, co stawia nas w czołówce tych badań.
Dane są analizowane w rdzeniu spektrometrii mas KU, aby uzyskać solidną wiedzę na temat tego, jak właściwości molekularne śliny komarów mogą zmieniać się w różnych warunkach.
„Po zebraniu danych analiza wymaga obszernego przetwarzania końcowego, w tym interpretacji i porównania, w czym mam ponad 24-letnie doświadczenie” – powiedział Saraf. „W ten sposób nawiązaliśmy współpracę z USDA.”
Według badaczki z ALK stosowana w jej laboratorium metoda analizy proteomów jest solidna i czulsza niż inne metody, co pozwala na znacznie bardziej szczegółowe badania przebiegu czasowego.
„Planujemy zbadać te zmiany w różnych warunkach, w tym w zmianach środowiskowych u komara po zakażeniu wirusem” – powiedziała. „Koncentrujemy się na ślinie komarów, która ma kluczowe znaczenie, ponieważ podobnie jak w przypadku pasożyta (Plasmodium) wywołującego malarię, arbowirusy przenoszone są przez ślinę podczas ukąszenia komara”.
Saraf i jej zespół przeanalizują także ślinę grupy kontrolnej komarów niezakażonych wirusem, ale trzymanych w takich samych warunkach żywienia i czasie trwania infekcji jak w grupie testowej. Ostatecznym celem jest identyfikacja konkretnych białek będących przedmiotem zainteresowania w przyszłych badaniach interakcji gospodarz-wektor-wirus, które mogłyby stać się potencjalnymi celami terapii lekowych.
Przyszłe kierunki i implikacje
Do tej pory zespół Sarafa pracował z niezainfekowanymi komarami, aby ustalić podstawowe dane. Po zatwierdzeniu i zatwierdzeniu protokołów inaktywacji prace obejmą próbki od komarów zakażonych arbowirusem na poziomie 2 bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2).
„Będziemy identyfikować różnice i zmiany na poziomie proteomu, porównując próbki kontrolne i zakażone na różnych etapach” – powiedział badacz z KU. „Celem jest określenie zachodzących zmian w białkach, ponieważ mogą one potencjalnie posłużyć jako kandydaci do opracowania szczepionki. Najpierw będziemy musieli wybrać kandydatów, dlatego używamy kontroli w tych samych warunkach i bez infekcji. Musimy ostrożnie pobrać z obu produktów równe ilości białka, aby zapewnić dokładne porównania — zasadniczo będziemy w stanie porównywać „jabłka z jabłkami”.
Produktem pracy Sarafa jest lista zmian w białkach, zarówno jakościowych, jak i ilościowych, mająca na celu wzmocnienie dowodów dostępnych innym badaczom i twórcom leków.
„Ostatnim razem nasi współpracownicy z USDA uznali tę listę za bardzo interesującą i zgodną z tym, co opisano w literaturze” – powiedziała. „Celem będzie wybór kandydatów do dalszych studiów”.
Badanie zostało sfinansowane przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych.
